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三羧酸循環系列檢測主要基于代謝組學分析技術，結合高效液相色譜 - 質譜聯用（HPLC-MS/MS）、氣相色譜 - 質譜聯用（GC-MS）等方法，對三羧酸循環中的關鍵中間代謝物（如檸檬酸、異檸檬酸、α- 酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等）進行定性和定量分析。
其核心原理是利用不同代謝物在色譜柱中的保留行為差異實現分離，再通過質譜檢測器對分離后的代謝物進行特異性識別和定量。通過比較樣品中這些中間代謝物的含量變化，可反映三羧酸循環的代謝活性及相關生理病理狀態。
儀器與試劑
（一）儀器
高效液相色譜 - 串聯質譜儀（HPLC-MS/MS）：配備合適的色譜柱（如 C18 柱，2.1mm×150mm，3.5μm）、自動進樣器、柱溫箱等。
氣相色譜 - 質譜聯用儀（GC-MS）：配備毛細管色譜柱（如 DB-5MS，30m×0.25mm×0.25μm）、電子轟擊離子源（EI）等。
高速冷凍離心機（轉速≥15000r/min，溫度可調控至 4℃）。
超聲波提取儀。
氮吹儀。
超純水制備系統（如 Milli-Q 系統）。
天平（精度為 0.0001g）。
移液器（10μL、100μL、1mL、5mL 等）。
離心管（1.5mL、10mL、50mL）。
容量瓶（1mL、10mL、50mL、100mL 等）。
微孔濾膜（0.22μm，有機相和水相）。
（二）試劑
三羧酸循環中間代謝物標準品：檸檬酸、異檸檬酸、α- 酮戊二酸、琥珀酸、富馬酸、蘋果酸等，純度均≥98%。
甲醇：色譜純。
乙腈：色譜純。
甲酸：色譜純。
乙酸銨：分析純，用于配制流動相緩沖液。
正己烷：色譜純。
叔丁基甲醚：色譜純。
內標物：如氘代檸檬酸（citric acid-d4）、氘代琥珀酸（succinic acid-d6）等，純度≥98%。
超純水：由超純水制備系統制備。
標準溶液的配制
單標儲備液的配制：分別準確稱取一定量的各三羧酸循環中間代謝物標準品，用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液溶解并定容，配制成濃度為 1.0mg/mL 的單標儲備液，置于 - 80℃冰箱中避光保存，有效期為 3 個月。
混合中間液的配制：分別準確移取一定體積的各單標儲備液，用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液稀釋定容，配制成濃度為 100μg/mL 的混合中間液，置于 - 20℃冰箱中避光保存，有效期為 1 個月。
系列工作標準溶液的配制：準確移取不同體積的混合中間液，加入適量內標物（使內標物濃度保持恒定），用甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液稀釋，配制成濃度為 0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的系列工作標準溶液，現配現用。
樣品處理
（一）樣品采集與保存
動物組織樣品：采集所需動物組織（如肝臟、心肌等），迅速用預冷的生理鹽水沖洗去除血液，濾紙吸干水分，切成小塊，放入液氮中快速冷凍，然后轉移至 - 80℃冰箱中保存。
細胞樣品：收集對數生長期的細胞，用預冷的 PBS 緩沖液洗滌 2-3 次，離心（1000r/min，4℃，5min）棄上清，加入適量液氮冷凍，-80℃冰箱保存。
植物樣品：采集植物組織（如葉片、果實等），洗凈后用濾紙吸干水分，液氮冷凍后，-80℃冰箱保存。
（二）樣品提取
稱取約 50mg 冷凍樣品置于 1.5mL 離心管中，加入 500μL 預冷的甲醇 - 水（體積比 80:20）提取液（含內標物），用組織研磨儀在低溫下研磨至勻漿。
超聲提取 30min（功率 300W，溫度 4℃），然后在 15000r/min、4℃條件下離心 15min，取上清液置于另一離心管中。
向殘渣中加入 300μL 上述提取液，重復超聲提取和離心步驟，合并兩次上清液。
（三）凈化與濃縮
向合并的上清液中加入 200μL 正己烷，渦旋混合 1min，12000r/min、4℃離心 10min，棄去上層有機相，保留下層溶液。
將下層溶液轉移至氮吹管中，用氮吹儀在 30℃下吹至近干，加入 200μL 甲醇 - 水（體積比 50:50）混合溶液復溶，渦旋混合 1min。
15000r/min、4℃離心 10min，取上清液通過 0.22μm 微孔濾膜（水相）過濾，濾液置于進樣瓶中，待測。
檢測條件
（一）HPLC-MS/MS 檢測條件
色譜條件
色譜柱：C18 柱（2.1mm×150mm，3.5μm）。
柱溫：30℃。
流動相：A 相為 0.1% 甲酸水溶液，B 相為乙腈。
梯度洗脫程序：0-3min，5% B；3-10min，5%-30% B；10-15min，30%-95% B；15-18min，95% B；18-18.1min，95%-5% B；18.1-22min，5% B。
流速：0.3mL/min。
進樣量：5μL。
質譜條件
離子源：電噴霧離子源（ESI），正負離子模式切換。
離子源溫度：350℃。
噴霧電壓：正離子模式 4000V，負離子模式 3500V。
鞘氣壓力：35psi。
輔助氣壓力：10psi。
碰撞氣壓力：1.5mTorr。
檢測模式：多反應監測（MRM），各代謝物的母離子、子離子、碰撞能量等參數根據標準品優化確定。
（二）GC-MS 檢測條件（針對部分揮發性代謝物）
色譜條件
色譜柱：DB-5MS 毛細管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。
進樣口溫度：250℃。
載氣：氦氣（純度≥99.999%），流速 1.0mL/min。
進樣方式：分流進樣，分流比 5:1。
進樣量：1μL。
柱溫程序：初始溫度 60℃，保持 2min；以 8℃/min 升溫至 200℃，保持 3min；再以 15℃/min 升溫至 280℃，保持 5min。
質譜條件
離子源：電子轟擊離子源（EI），電子能量 70eV。
離子源溫度：230℃。
接口溫度：280℃。
質量掃描范圍：m/z 50-500。
溶劑延遲：3min。
檢測模式：選擇離子監測（SIM），根據各代謝物標準品質譜圖確定特征離子。
測定步驟
儀器預熱：打開 HPLC-MS/MS 或 GC-MS 儀器，進行預熱，確保儀器各項性能參數穩定。
標準曲線繪制：將系列工作標準溶液按濃度由低到高的順序注入儀器，每個濃度重復進樣 3 次，記錄各代謝物和內標物的峰面積。以各代謝物濃度與內標物濃度的比值為橫坐標，各代謝物峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線。
樣品測定：將處理好的樣品溶液注入儀器，按照上述檢測條件進行測定，記錄樣品中各代謝物和內標物的峰面積。每個樣品重復進樣 3 次，取平均值。
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